Наука и технологии России

Вход Регистрация

Свет и генетика

Нередко научные идеи высказываются до того, как появляется техническая возможность их проверить. Их авторам остаётся либо ждать появления необходимого инструментария, либо разработать его самостоятельно. В нейробиологии, когнитивных науках гипотез, ждущих испытания экспериментом, на редкость много – в силу грубости существующих методов исследования, не сопоставимых со сложностью объекта. Однако новому поколению учёных можно позавидовать: у них появился способ получить ответы на многие ранее заданные вопросы и качественно продвинуться в понимании механизмов работы мозга.

Включение отдельных клеток с помощью света

В 2005 году стало очевидно, что в области нейронаук начался принципиально новый этап. Геро Мизенбек (Gero Miesenböck) из Йельского университета опубликовал впечатляющий эксперимент с мухами-дрозофилами, запуская у них характерное поведение с помощью света. Стереотипная реакция избегания, когда муха резко отталкивается от поверхности и улетает, управляется небольшим числом нейронов в её центральной нервной системе. С помощью генетических манипуляций и каскада реакций, основанного на фотолизе, Мизенбеку удалось сделать эти нейроны светочувствительными. Таким образом, направляя пучок ультрафиолета на муху, он мог избирательно возбуждать только те клетки, которые отвечают за данный тип поведения. На каждую вспышку света насекомое отвечало одним и тем же действием – мгновенно пыталось взмыть вверх. В контрольных экспериментах обычные мухи, нейроны которых не обладали искусственной светочувствительностью, подобных реакций на свет не проявляли. Равно как и те мухи, которых Мизенбек лишил головы, чтобы снять все сомнения в том, что поведение вызывается именно воздействием света на клетки, расположенные в грудных ганглиях, а не в зрительной системе. Безголовые животные (они могут жить до двух суток) также пытались улететь прочь, как только их освещали.

Спустя полгода биоинженеры из Стэнфордского университета и Института биофизики им. Макса Планка во главе с Карлом Дайсеротом (Karl Deisseroth) продемонстрировали новый способ фотостимуляции нейронов млекопитающих. Он обеспечивал беспрецедентно высокое временное разрешение избирательного управления активностью клеток. Методика основывалась на вирусной доставке в нейроны гена природного светочувствительного белка и была существенно проще той, что использовал Мизенбек. Эта публикация стала поворотным пунктом в обширной области нейрофизиологических исследований. В распоряжении учёных оказался эффективный инструмент узконаправленного действия, позволяющий проводить эксперименты, о которых раньше можно было только мечтать.

Идея выборочно активировать клетки одного типа, не затрагивая при этом их соседей, занимала учёных давно. Проблема в том, что нейроны, расположенные в одной области мозга, могут заметно отличаться друг от друга по характерной форме, набору экспрессирующихся генов, паттернам возбуждения, роли в общих взаимодействиях, а также по тому, какие молекулярные события приводят к изменению их функций, вызывая болезненные состояния. Основные известные способы воздействия на нервную ткань, такие как магнитное или электрическое поле, не обеспечивают избирательности, «поражая» все клетки данного объёма. Это сравнимо с ситуацией, когда все инструменты оркестра начинают играть свои партии одновременно, на одинаковой громкости, производя какофонию вместо музыки. С другой стороны, фармакологическое вмешательство не позволяет управлять клетками с быстротой, сравнимой со скоростью их потенциалов действия. По этой причине разные виды терапевтической стимуляции, помимо запланированных улучшений, нередко сопровождаются побочными эффектами. Специалисты понимали, что возможность прицельно включать и отключать клетки одного класса, не мешая при этом остальным, качественно изменит ситуацию. Это позволит исследовать происходящие процессы в мозге на более детальном уровне. Долгожданный прорыв случился совсем недавно, несколько лет назад, и связан с развитием нового направления биотехнологии – оптогенетики.

Её суть можно определить как способ придавать светочувствительность избранным клеткам и затем, воздействуя светом заданной длины волны, вызывать в них (и только в них) нужные изменения. Применительно к нейронам это означает, что вспышка света приводит к мгновенной генерации спайка. При этом у близлежащих клеток, если они не являются целью воздействия, попадающий на них свет не вызывает никаких реакций. Это в корне отличается от электрической или магнитной стимуляции, которая не позволяет возбуждать клетки избирательно. Чтобы сделать нейрон светочувствительным, обычно используют природный белок каналородопсин-2 (ChR2), обнаруженный у одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Ген этого белка снабжают промотором молекулярной последовательностью, запускающей экспрессию гена в заданном типе нейронов – упаковывают в безопасный вирус и вводят в нужную область ткани. Вирус проникает в клетки-мишени, там ген начинает работать, и на мембранах нейронов появляются белки ChR2. В ответ на попадание света родопсины раскрывают в мембране каналы, пропуская через них заряженные ионы. Это и приводит к разрядке нейрона. Всё происходит настолько быстро, что позволяет управлять потенциалами действия в масштабе миллисекунд. Будучи сравнительно простой, данная технология даёт возможность ставить задачи, к которым ранее сложно было подступиться. Например, управляя активностью выборочной группы нейронов в живом мозге, можно проследить, какое поведение или какую патологию они способны вызывать.

Признавая потенциал оптогенетики, журнал Nature Methods объявил её методикой 2010 года (Method of the year).


Как работает оптогенетика, поясняет журнал Nature

Как это работает в экспериментах

Не так давно при помощи оптогенетической стимуляции группе Дайсерота удалось выявить у мышей систему нервных путей, активность которых заметно снижает уровень стресса. Как известно, тревожные расстройства на сегодняшний день входят в число наиболее распространённых и с трудом поддающихся лечению недугов. Учёные из Стэнфорда показали, что в миндалине – области мозга, обычно ассоциирующейся с нагнетанием чувства страха – есть определённое число нейронов, обладающих неожиданным свойством. Возбуждение их аксонных окончаний (терминалей) полностью убирает симптомы беспокойства. Поскольку оптогенетика позволяет избирательно активировать не только отдельные клетки, но и их отростки независимо от тела нейрона (манипулируя толщиной и направленностью светового луча), Дайсероту с коллегами удался впечатляющий по прицельности эксперимент. После того как нужные нейроны обзавелись светочувствительными белками, в миндалину подопытных мышей вставляли тончайший волоконно-оптический кабель. Тщательно определив место стимуляции, учёные буквальным образом включали свет в мозге испытуемых животных. Перемена была разительной: предпочитавшие жаться у стенок мыши начинали беззаботно выходить на открытые пространства и исследовать окружающую обстановку. Что примечательно: электрическая стимуляция миндалины электродами обычно приводит к повышению тревожности, и обнаружение в ней нервного субстрата, обладающего противоположным эффектом, стало возможным лишь благодаря оптогенетике.

Участок_мозга_мыши_отвечающий_за_беспокойство Используя световую технологию, называемую оптогенетикой, учёные нашли особый участок мозга у мышей, который «включает» и «отключает» чувство беспокойства. Фото: NIH

 

Используя этот метод, в 2007 году учёные научились вызывать пробуждение у спящих мышей, освещая нейроны, расположенные в их латеральном гипоталамусе и вырабатывающие вещество гипокретин. Нехватку этого нейромедиатора обычно связывают с нарколепсией, редким расстройством, при котором человека мучают внезапные и непреодолимые приступы сна. Благополучно заснувшие грызуны, с вставленным в мозг оптико-волоконным кабелем, просыпались, когда внутри их головы включался свет. Причём не имело значения, находились они в этот момент в фазе медленного или быстрого сна. Таким образом, активации конкретной группы нейронов было достаточно, чтобы организм перешёл из состояния сна в состояние бодрствования.

Не в последнюю очередь за счёт того, что оптогенетика позволяет работать с мышами, млекопитающими с достаточно сложным поведением, она получает всё большее распространение в нейрофизиологических исследованиях. В 2011 году биологи Калифорнийского технологического института выявили любопытное взаимоотношение агрессии, спаривания и связанных с ними клеток.

Как оказалось, на уровне нервного субстрата от любви до ненависти действительно один шаг.

В крошечной области крошечного мышиного мозга, вентролатеральном отделе ядра гипоталамуса (VMHvl), сосредоточены нейроны, активизирующиеся при нападении самца на соперника. И там же находится другая группа нейронов, которая включается при спаривании с самкой. Данные были получены путём считывания активности мозга. Вместе с тем оптогенетика, в отличие от наблюдений за происходящими процессами, позволяет напрямую их инициировать. В экспериментах Дайю Лин (Dayu Lin) самцы мыши со светочувствительными клетками в указанном участке гипоталамуса в обычной обстановке не меняли своего поведения, даже если учёные запускали фотостимуляцию. Однако при появлении другого самца животные бросались в бой, стоило только включить «лампочку» в их голове. При этом они так же рьяно атаковали кастрированных самцов, самок и даже двигающуюся перчатку, что не характерно для мышей. Далее, используя второй светочувствительный белок, реагирующий на другую длину световой волны и вызывающий гиперполяризацию мембраны, Лин могла подавлять работу клеток вместо их возбуждения. В этом случае атакующее поведение у грызунов наблюдалось редко. Таким образом, удалось показать, что в присутствии «соперника» активация конкретной группы нейронов – это необходимое и достаточное условие для проявления агрессии. Но что более интересно, стимуляция этих нейронов не давала никакого эффекта, когда самец занимался любовью с самкой. Естественно предположить, что в организме существует мощный механизм торможения «агрессивных нейронов», запускающийся во время репродуктивного поведения. Здесь уместно вспомнить давнюю идею нобелевского лауреата, этолога Николааса Тинбергена о том, что нервные цепи, ответственные за секс и агрессию, должны быть расположены анатомически близко друг к другу. Описанный выше эксперимент обнаруживает локализацию таких цепей (по крайней мере, у мышей) и позволяет подумать о причинах их близости. Вероятно, необходимость предотвратить нежелательное атакующее поведение в самый ответственный (для эволюции) момент привела к тому, что субстраты того и другого тесно увязаны. Преступления на сексуальной почве, сопровождающиеся жестокостью и насилием, могут быть следствием сбоев в работе этого тормозящего механизма.

С помощью оптогенетики, существующей в качестве рабочего инструмента лишь несколько лет, удалось продвинуться в исследовании того, как отдельные виды клеток участвуют в обеспечении функций нервной системы. В частности, воздействуя светом, учёные восстанавливали зрение и дыхание у свободноподвижных животных. Показано, как, включая дофаминовые нейроны, можно сформировать у мышей условный рефлекс, а управляя моторными – заставить покоящееся животное бегать по кругу. Во всех случаях единственным средством воздействия служит пучок света, направляемый в ту или иную область мозга. В настоящее время данная технология стремительно набирает популярность и берётся на вооружение ведущими лабораториями мира, так как предоставляет уникальные возможности для экспериментальных исследований. Вместе с тем она сравнительно недорога – стоимость полного комплекта оборудования не превышает нескольких тысяч долларов.

Ближайшие перспективы и возможности

Надо признать, что необходимые для оптогенетики «ингредиенты» были в распоряжении учёных ещё десятилетия назад. Например, светочувствительный белок бактериородопсин, присутствующий у галобактерии, обитающей в Мёртвом море, был выделен в 1971 году. Технологии 1980-х вполне позволяли экспрессировать чужеродный ген практически в любом типе клеток. Таким образом, проверить работу бактериородопсина в нейроне можно было уже тогда, однако никто не попытался этого сделать. На рубеже веков подобная идея уже витала в воздухе. В 2002 году Геро Мизенбек осуществил фотостимуляцию нейронов в чашке Петри (in vitro), взяв для этой цели ген глазных фоторецепторов мухи. Через год Георг Нагель (Georg Nagel) использовал белок каналородопсин-2, показав его эффективность на ооцитах лягушки. Родопсин, выбранный Нагелем, отлично работал в чужеродных клетках и позволял значительно упростить всю схему эксперимента. Наконец, в 2005-м группа Дайсерота совместно с Нагелем опубликовала статью, где впервые сообщалось об успешном применении каналородопсина-2 для возбуждения нейронов млекопитающих. Научному миру фактически была явлена готовая технология, и с этого момента число экспериментов с применением оптогенетики начало расти в геометрической прогрессии.

Потенциально её роль в нейрофизиологии может оказаться сравнимой с тем, что в своё время сделал для астрономии телескоп. Профессор Гиоргий Бусаки (Gyorgy Buzsaki) из Университета Ратгерса, один из наиболее цитируемых специалистов в области нейронаук, предрекает Карлу Дайсероту, лидеру нового направления, за уже сделанную работу Нобелевскую премию. Дайсерот занимает в Стэнфорде должность, звучащую несколько необычно: профессор биоинженерии и психиатрии. Однако она точно отражает суть происходящих на наших глазах изменений. Он начинал как практикующий психиатр и, возглавляя биоинженерную лабораторию, по-прежнему раз в неделю принимает пациентов, чтобы, по его собственным словам, «оставаться в форме». Многолетние наблюдения различных психических расстройств, попытки вылечить больных самыми современными средствами, порой не приносящие результата, заставили его всерьёз задуматься, насколько слабо пока поняты принципы работы человеческого мозга. «Мы не знаем, что представляет собой психическое заболевание на фундаментальном уровне», – признаётся Дайсерот. Традиционно его рассматривают в терминах химического дисбаланса, изменений уровней нейромедиаторов, но как это сочетается с высокоскоростным обменом электрическими сигналами, идущим в мозге повсеместно?

Появление оптогенетики, возможно, приведёт к пересмотру причин неврологических нарушений, считает Дайсерот.

В качестве источника болезненных состояний, вместо нехватки/избытка того или иного вещества, может выступать аномальный характер ритмических возбуждений групп нейронов или сбои в передаче импульсов между различными участками мозга. Таким образом, учёный рассчитывает проложить прямой путь от биоинженерии к решению неуловимых проблем психики.

За несколько лет, прошедших с момента появления ключевой публикации 2005 года, оптогенетика вышла из младенческого возраста. Биоинженеры, помимо поиска новых светочувствительных белков в природе, уже синтезируют искусственные. Широкий ассортимент опсинов, реагирующих на разную длину световой волны, позволяет включать несколько классов нейронов в одном организме, просто меняя свет, допустим, с голубого на жёлтый. Кроме того, комбинируя белки, по-разному проводящие ионы через мембрану, можно активировать или тормозить работу клеток в зависимости от задачи. Получили распространение гибридные системы, где световая стимуляция сочетается со считывающим электродом. В этом случае инициация импульса и его регистрация осуществляются разными устройствами, не перекрывающими действие друг друга. В принципе, можно создать петлю обратной связи, при которой интенсивность и частота вспышек будет зависеть от поведения или физиологических параметров животного, и тем самым получить двустороннюю связь потоков «входа» и «выхода» в реальном времени. Нужно также отметить, что метод световой стимуляции не ограничен нейронами и потенциально применим ко всем типам клеток. Так, можно придать светочувствительность некоторым клеткам сердца и затем воздействовать на них ритмическими вспышками, превратив в пейсмейкеры. Такой кардиостимулятор будет дешевле, менее инвазивным и, кроме того, не будет страдать от воздействия сильных магнитных полей.

Разумеется, предсказать, будет ли опробована оптогенетика на человеке, сейчас сложно. В конце концов, технология предполагает внедрение гена, и это естественным образом порождает ряд принципиальных проблем, не относящихся напрямую к науке. Однако с технической стороны препятствий, похоже, нет. Эдвард С. Бойден (Edward S. Boyden) из Массачусетского технологического института, давний коллега Дайсерота, продемонстрировал, что метод успешно работает на обезьянах: светочувствительные нейроны в лобной коре макак реагировали на фотостимуляцию в течение нескольких месяцев, пока шёл эксперимент. Так или иначе, оптогенетика находится в начале своего пути, и есть все основания предполагать, что главные открытия у неё впереди. Их совершит тот, кто быстрее других удачно объединит уникальные возможности технологии с научной интуицией.

Справка STRF.ru:
Литература:
Zemelman BV, Lee GA, Ng M, Miesenbock G. (2002). «Selective photostimulation of genetically chARGed neurons». – Neuron – Neuron Nagel, G., T. Szellas, et al. (2003). «Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel». – PNAS Lima SQ, Miesenbock G (2005). «Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons». – Cell Boyden, E. S., F. Zhang, et al. (2005). «Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity». – Nature Neuroscience Adamantidis, A. R., F. Zhang, et al. (2007). «Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons». – Nature Lagali PS, Balya D. et al. (2008). «Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration». – Nature Neuroscience Alilain WJ, Li X, Horn KP, Dhingra R, Dick TE, Herlitze S, Silver J (2008) «Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury». – J. Neuroscience
Han, X, Qian, X, et al. (2009). «Millisecond-timescale optical control of neural dynamics in the nonhuman primate brain». – Neuron Bruegmann, T., D. Malan, et al. (2010). «Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo». – Nature Methods
Tye K. et al. (2011). «Amygdala circuitry mediating reversible and bidirectional control of anxiety». Nature Lin D. et al. (2011). «Functional identification of an aggression locus in the mouse hypothalamus». Nature

РЕЙТИНГ

5.00
голосов: 18

Галереи

Микромир. Искусство науки - 2011

Работы участников конкурса

252 фото

Обсуждение